凝胶龟裂是由于输人电流过大,凝胶过热造成,解决的办法是降低电流,延长电泳时间,如果电流太小造成凝胶板走的距离太短。电泳时电压太小,时间长,易造成蛋白质凝胶带发生扩散,解决的办法是升高电压,缩短电泳时间。
琼脂糖凝胶电泳具体操作步骤是什么？需要注意什么事项？
1,如果你的DNA分子量很大,用TBE跑就慢,可用TAE
2,胶的浓度太高,提取的DNA用06%-08%的胶,PCR结果用10%-12%的
另外说一下：你的电压是否太高,就算120V跑得快,那跑出来,条带是否会比较粗糙,其形状给人以嚣张的感觉一般应该根据电泳槽长度算出电压,电压应是5-10V/CM左右我用的电压是80V,电泳槽长度大概25公分左右,电压低一些,时间长一些,但条带含蓄内敛,姿态优美,赏心悦目,风魔万千老师
琼脂糖凝胶电泳中dna的影响迁移速度有哪些
一、操作步骤：
1、电泳方法
一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。
2、凝胶浓度
对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在05～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。
3、缓冲液
常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
4、电压和温度
电泳时电场强度不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。
5、DNA样品的纯度和状态
注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。
6、DNA的上样
正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。
7、Marker的选择
DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。
8、凝胶的染色和观察
实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。
二、注意事项：
1、巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
2、高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
3、电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
4、如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象。
5、变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。
6、太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。
扩展资料
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
但由于其孔径相比于蛋白质太大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。
蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度002~005为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为02-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
-琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳中dna的影响迁移速度：
1、DNA的分子大小及构型
不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环DNA（covalently closed circular,cccDNA）>直线DNA>开环的双链环状DNA线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行。
因而迁移得越慢当琼脂糖浓度太高时,环状DNA（一般为球形）不能进入胶中,相对迁移率为0（Rm=0）,而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm>0）,由此可见,这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度
2、琼脂糖浓度
一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系凝胶浓度的选择取决于 DNA分子的大小分离小于05kb的DNA段所需胶浓度是12-15%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为03-07%,DNA段大小间于两者之间则所需胶浓度为08-10%
3、DNA分子的构象
当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,
而线状双链DNA移动最慢如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA
4、电源电压
琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明,在低浓度、低电压下,分离效果较好在低电压条件下,线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比
但是,在电场强度增加时,不同分子量的DNA段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小要使大于2kb的DNA段的分辨率达到最大电场强度不宜高于5V/cm
5、嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％
6、离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH80)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温
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