胚胎细胞克隆

胚胎工程

胚胎工程是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术。包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养等技术。这些技术进一步挖掘动物的繁殖潜力，为优良牲畜的大量繁殖，稀有动物的种族延续提供有效的解决办法。在畜牧业和制药业等领域发挥重要的作用，具有光明的应用前景。

生殖细胞的发生和受精

一、哺乳动物有性生殖和发育的概述

一实例：人的生殖发育过程

二有性生殖和发育的四个阶段：

⒈有性生殖

①配子形成

②受精作用

⒉个体发育

①胚胎发育

②胚后发育

二、配子形成——精子和卵细胞的发生

一精子的发生

⒈时机：从雄性动物的初情期（相当于人的青春期）开始，到生殖机能衰退

⒉场所：睾丸的曲细精管内

⒊过程：

⒋产物：精子

形态：形似蝌蚪，分头、颈和尾三部分

长度在几十微米到几百微米之间（不同种生物精子长度不同）

结构：头部顶端有顶体（由高尔基体发育而来）

头的主要部分是细胞核

尾的基部有线粒体聚集形成的线粒体鞘

特性：尾部能够剧烈摆动，使精子获得运动能力

二卵子的发生

⒈时机：卵泡在胎儿时期形成，从初情期开始有卵子成熟

⒉场所：主要在雌性的卵巢中完成

⒊过程：

⒋产物：卵子

结构：卵子中有营养物质丰富的卵黄（细胞质）

卵子外有由卵丘细胞构成的放射冠

三、受精

一准备阶段

⒈精子的准备——精子获能

成熟的精子在雌性动物生殖道内发生相应生理变化，使得精子获得与卵细胞结合的受精能力的过程

⒉卵子的准备

卵子从卵巢排出进入输卵管，经过2～3小时后才具备与精子受精的能力

二受精阶段

⒈实例：人的受精过程

⑴精子穿越放射冠和透明带（顶体反应）

⑵进入卵黄膜（精卵识别、形成受精膜）

⑶原核形成（精子尾部脱落形成雄原核、卵子完成减数第二次分裂形成雌原核）

⑷配子结合（雌雄原核融合，形成一个含二倍染色体的合子）

⒉特征

⑴受精部位：输卵管的膨大部位

⑵适宜时间：排卵后6～24h

⑶受精条件：精子密度足够大是精卵相遇及融合的前提条件

⑷融合特点：一个卵细胞只与一个精子融合形成受精卵

胚胎发育的基本过程

一、胚胎发育

一胚胎发育过程（蛙受精卵的发育）

二特征

⒈卵裂期细胞数量不断增加，但胚胎的总体积并不增加，或有所缩小

⒉桑椹胚时期及其以前的细胞，每一个细胞都具有发育成完整胚胎的潜能，属于全能细胞

⒊囊胚中有一个含有液体的囊腔——囊胚腔

⒋原肠胚由三个胚层构成，三个胚层在后期的发育过程中，分化成不同的组织器官，在原肠胚期出现一个新的空腔——原肠腔

⒌着床后，胚胎通过胎盘与母体相连，从母体获得生长发育所需的营养

二、胚后发育

实例：人出生后的发育分期

分 期 年 龄 主 要 发 育 特 征

婴儿期 新生儿

初期幼儿期 出生后

1个月 呼吸等功能开始

循环的调节

中期幼儿期 1月～1岁 生长发育迅速、器官功能成熟

后期幼儿期 1～3岁 生长减速、步行和随意运动发展

学 前 期 3～6岁 生长慢、神经调节发展、学习发展

童 年 期 女性6～10岁

男性6～12岁 以一定速度生长；动作技能熟练；智能发展

青春前期 女性10～12岁

男性12～14岁 生长速度加快；体重增加快；

内分泌初期分化

青春中期 女性12～14岁

男性14～16岁 出生后最大生长期；

第二性征出现

青春后期 女性14～18岁

男性16～20岁 生长降速或停止，肌肉增长；生殖器迅速发育，性成熟

胚胎工程的技术及应用

一、胚胎移植

一定义：将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之发育成新个体的技术。

二意义：

⒈充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力

⒉缩短雌性优良个体本身的繁殖周期

⒊提高繁殖效率，后代数是自然繁殖的十几倍到几十倍

三基本程序（见教材77页图）

二、胚胎分割

一定义：采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。

二原理：初期胚胎的细胞具有很高的全能性，能够发育成完整个体。来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，拥有相同的优良性状。

三基本程序：

三、体外受精

一卵母细胞的采集和培养

⒈促排卵法：用促性腺激素处理，促雌性动物排卵，从输卵管中冲取卵子

⒉直接获取法：

从已屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞，在体外经人工培养为成熟的卵子

从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞，在体外经人工培养为成熟的卵子

二精子的采集和获能

⒈精子的采集

⑴假阴道法

⑵手握法

⑶电刺激法

⒉精子的获能

⑴培养法

⑵化学诱导法

三受精

⒈获能的精子和培养成熟的卵子，在受精溶液中完成受精过程

⒉在人工条件下，将精子注入到成熟的卵子中，完成人工授精

胚胎干细胞的研究及应用

1999年底，在美国《Science》（《科学》杂志）公布的年度世界十大科学成果评选中，“干细胞研究的新发现”荣登十大科学成果之首，而举世瞩目的、耗资巨大的人类基因组计划只居第二位，足见干细胞研究的重要性。

ES细胞技术是一个发展空间极为广阔的研究领域，很多亟待解决的问题，将成为当前乃至未来人们攻坚的热点。

一、胚胎干细胞（ES细胞）的来源和主要特点

（1）ES细胞来源于早期胚胎，是从早期胚胎细胞中分离出来的。

（2）体积较小，细胞核大，核仁明显，具有胚胎细胞的特性；

（3）具有发育的全能性，可分化为成年动物任何一种组织细胞。

（3）在体外培养条件下，ES细胞可不断增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可以进行某些遗传改造。

二、ES细胞的主要用途

（1）可用于研究哺乳动物个体发生和发育的规律，也是在体外条件下研究细胞分化的理想材料。

（2）ES细胞通过诱导分化可产生新的组织细胞，用于治疗人类的组织损伤和某些顽症。

（3）可通过ES细胞的体外诱导分化，定向培育人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和移植后免疫排斥的问题。

知识拓展

一、辅助生育技术的发展史

哺乳动物体外受精技术的研究由来已久，早在1890年，英国胚胎学家Walter Heape和外科医生Samual Ruckley，将安哥拉白色长毛兔两个4-细胞胚胎植入有色短毛雌兔子宫内，生下的6只幼兔中有2只白色长毛兔。宣布胚胎移植的首次成功。1947年，美籍华人张明觉将兔受精卵保存在5℃-7℃，移植后能发育成正常的幼兔。这些研究均是将体内受精卵进行移植，而体外受精却相当困难。1951年，张明觉和Austin观察到哺乳动物的精子获能现象，即精子有能力穿入卵之前，必须经历一系列的生理，生化改变。这样张明觉在其研究的基础上，并结合Heape的胚胎移植技术诞生第一只体外受精—胚胎移植的幼兔。这些开创性的研究为人类体外受精—胚胎移植奠定了基础。

20世纪60年代，人类对卵及卵子成熟的研究积累了丰富的知识。随着腹腔镜发明并将其应用于取卵手术中。1977年Steptoe和Edwards利用腹腔镜取卵，在体外受精，并当受精卵发育到8-Cell胚胎移植入母体子宫内获得妊娠。并于1978年7月，在英国剑桥大学诞生了世界首例试管婴儿路易丝.布朗(Louice Brown)即普通地称为第一代试管婴儿。1985年4月台湾首例试管婴儿诞生。1986年12月，香港首例试管婴儿诞生。我国首例试管婴儿于1988年3月北京医科大学三医院诞生。

二、利用胚胎移植繁育马廘

马鹿是国家二级保护动物，随着种群、数量的减少，马鹿出现种群退化、近亲繁殖等现象，胚胎移植是解决这一问题的有效方法之一。

新疆奇台林场马鹿养殖基地是中国唯一的天山马鹿种源保护与繁育基地。 2004年6月19日，新疆奇台林场的马鹿养殖基地共降生7头胚胎移植的小马鹿，其中5头存活。

据奇台林场场长马明奎介绍，与其它小马鹿相比，胚胎移植的小马鹿个头明显较大、身体更为强壮、跑跳等能力更强。

三、世界首例分离XY精子性别控制试管水牛在广西诞生

“水牛生公生母，今后完全可以人为控制！”广西大学动物繁殖研究所所长、博士生导师卢克焕教授，在2006年2月14日向媒体宣布了由他主持取得的分离XY精子性别控制试管水牛成果：2月13日上午11点20分，在广西水牛研究所的一头杂交母水牛，通过分离XY精子性别控制产下了雌性水牛双犊。据悉，这在世界尚属首例。

据介绍，这两头性控试管水牛犊体重均为29公斤。“姊妹花”出生经历了复杂、严密的科学设计：首先，用流式细胞仪分离出良种摩拉水牛精液的X精子和Y精子；然后，将X精子与本地母牛的卵母细胞进行体外受精生产性别控制的胚胎；最后将三枚雌性胚胎移植给一头受体母牛，经十月怀胎后生产出来。

该项由国家自然科学基金、广西壮族自治区人民政府主席基金、自治区科技厅科技攻关项目资金联合资助的水牛性别控制研究项目，由卢克焕教授主持，广西水牛研究所和广西畜禽品种改良站共同参与完成。

卢克焕说，该项成果的关键技术是分离XY精子技术。目前，广西大学动物繁殖研究所已掌握这一技术，分离水牛XY精子的准确率可达90%以上，这意味着水牛生公生母完全可以人为控制。

四、人工授精技术（体内）

（一）输精前的准备

1、输精器的消毒：输精器预先用清水或2%的碳酸钠溶液洗净，再以蒸汽消毒或用烘干箱干燥灭菌。

2、精液的准备：根据选配计划，选择受配母牛应采用的公牛精液。临输精前，将确认的细管或颗粒精液进行快速解冻（40摄氏度，必要时做活力检查），将输精器用蒸馏水冲洗2-3次，再装入精液。

3、母牛的准备：准确鉴定发情母牛，并将受配母牛保定在输精室配种架内（也可在牛舍内就地配种）。

（二）输精方法：人工授精常用直肠把握子宫颈法和开膣器法。现在大多使用前一种方法，它比开膣器法可提高受胎率10%以上，后一种方法，现已不用。

直肠把握法：

操作要领：输精前，输精者须带上塑料或橡胶长臂手套，并在手套外面涂上润滑剂（肥皂液等），右手持输精器。然后左手指合拢呈圆锥状，以螺旋钻似的动作，从肛门缓慢地插入直肠内，先将直肠的宿粪掏出，用清水洗净肛门、会阴及阴门周围，然后再次插入直肠内，隔直肠把子宫颈握住（有软骨样感觉），然后左手臂往下压一下，使阴门张开，或者助手用手指拨开阴门。右手持输精器由阴门插入，先向上倾斜插入一段（约5厘米左右），以避开尿道口，而后平插，当输精器尖端抵达子宫颈外口时，在左右手的协调作用下，让输精器轻轻越过子宫颈，即插到子宫颈内口与子宫体连接部，然后注入精液。注入时将输精器稍微往回拉一点，以避免肌肉堵塞尖端出口。注入后将输精器拉出子宫管再松开授精器胶球，以免吸回精液。实践证明，这种深部授精，精液不易倒流，可以提高受胎率。这是当今国内外普遍采用的一种授精方法。