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我看生物学

—— 一位大三学生

1.生物学发展的历史及现状(1)

自然科学起源于古希腊，生物学也不例外。当时实验作为科学尤其是生物学的一种手段尚未为人们所重视。早期的希腊哲学家认识到一些生理现象如运动，营养，感觉，生殖等等都需要加以解释，并认为只要对之加以思考（就像他们对待哲学问题一样）就能解决。这种错误的思想一直维持到文艺复兴时期实验科学从哲学中解放出来。

达尔文以前对生物学贡献最大的亚里士多德。他是对生物进行分类的第一人---虽然正式的分类法后来由林奈提出；他首次认识到比较法对于生物学的重要性，而比较法即便是在现代也是贯彻生物学研究始终的一条主线；更重要的是，他从哲学上提出了生物学不仅仅满足于回答“怎样”（生物体如何实现其功能的？）的问题，还要解决“为什么”（为什么生命现象会有这么多的目的性？）的问题。而这个“为什么”也就是现代进化生物学家们所提出的最重要的问题。

在文艺复兴时期，实验方法走进了生物学。当时解剖学盛极一时，维萨纽斯发明了新解剖工具，并出版了《人体解剖》一书。这一时期生物学最重大的发现来自哈维，提出并论证了血液循环学说，这在很大程度上得益于当时比较先进的解剖技术。另外著名的解剖学家Borelli曾在他的《动物的运动》一书中论述了关于行动的研究，如利用力学原理分析了血液循环和鸟的飞行问题。这大概是生物学与物理学的第一次结合。

正如伽利略用他的望远镜使物理学的触须伸向天空一样，引导生物学进入微观世界的是列文虎克和他的显微镜。这两个例子说明了仪器在科学研究中可能发挥的巨大潜力。这时期林奈提出了分类法，博物学也达到了前所未有的高峰，并与生物学一向的主流---解剖学结合起来，互相促进。这个时期生物学的主要兴趣很明显是生物有机体的描述、比较和分类。博物学和解剖学的积累，尤其是比较解剖学方面的数据，为后来的达尔文进化论奠定了基础。

1859年，根据其对戈拉帕哥斯岛和南美动物区系的研究和一些解剖学和博物学的资料，达尔文提出了进化论。进化论的革命性有两点：第一，所有有机体都可能来自共同的祖先；第二，进化是有原因的，首先产生遗传变异，然后对变异的个体进行自然选择，从根本上否定了拉马克的自发进化学说。

19世纪实验科学方面的一个重大进展是施莱登和施旺的细胞学说，这得益于显微镜的发明。另一个重大进展是孟德尔的遗传学说，遗传学在贝特森、摩根等人手中迅速的发展成一门宏大而成熟的科学。其中值得一提的是麦克林托克用经典遗传学的手段发现了转座子。19世纪中期，综合遗传学的理解和对种群进化的认识，形成了一个统一的进化学说---综合进化论。一些主要的进化生物学的概念如物种形成、进化趋势等可以在遗传学上得到新的解释和认识。

生物学的重大发现之一就是沃森和克里克发现DNA双螺旋结构。在那个时代，DNA作为遗传物质已经为Avery等证明，因此一个重要的问题是：DNA分子如何携带控制发育过程的全部信息？当时结构生物学手段刚刚建立起来，沃森和克里克利用X衍射信息重建了DNA双螺旋结构并指出了碱基配对的可能性。这是一次科学家非凡的洞察力和精巧的实验技能的完美结合。DNA双螺旋结构宣告了分子生物学时代的来临，在20世纪七八十年代，中心法则以及其内在的分子机制建立起来后，分子生物学在更大程度上作为一种有力的手段被应用，如阐明分子进化或者发育的机制等。中心法则确立后，很多有前瞻目光的科学家寻找生物学的新的出路，如Sydney Brenner提出用线虫研究发育和神经， Seymour Benzer提出用果蝇做神经和行为等。

纵观生物学发展的历史，所有学说和理论的提出都是有其时代背景的，如比较解剖学和博物学为达尔文进化论的提出建立了基础；遗传学的兴盛预示了DNA双螺旋结构的发现；分子生物学的建立使在分子水平研究进化与发育等。就像渐变进化论一样，生物学的发展也是渐变的。

2.生物学科研手段

生物学作为一门实验科学主要是建立在解剖学的基础上的。收集各式各样的标本，对人体和动植物进行解剖观察，曾是生物学的主导手段。达尔文的进化论同样是建立在细致的观察的基础上的。列文虎克用自制的显微镜第一次观察到了细胞，以及之后细胞学说的建立，体现了精确的仪器在生物学研究中的巨大威力。在分子生物学尚未建立以前的经典遗传学时代，将宏观现象（突变体）与微观世界（染色体）联系起来的正是显微镜。当时果蝇的巨大染色体（足以在光学显微镜下看到清晰的分带）为遗传操作和分析提供了很大的便利。在神经生物学上，著名的神经解剖学家Cajal曾用高尔基染色法对大量的神经系统组织标本进行显微观察，提出了神经元学说，并以超人的洞察力指出了神经系统信号传递的许多基本性质。

遗传和生化是进行功能性生物学研究的两大手段。然而在摩尔根的时代，经典的遗传学更着重于探索遗传的机制，即遗传物质是怎样传递的。遗传学真正作为一种对基因进行大规模的功能性研究和分析始于Nusslein-Volhard对影响果蝇体节分化的基因的一次gene screen(2)，首次将基因的功能与发育联系起来。几种模式生物的确立极大的方便了系统使用遗传学手段研究基因的功能以及相互之间的作用。现代遗传学可以分为两类：forward genetics和reverse genetics(3,4)。前者是依据从表型到基因型的思路，寻找影响某一生物体功能的基因，而后者则是从基因到表型，看某一感兴趣的基因是否对生物体的功能造成影响。reverse genetics一般是对一些重要的基因的同源基因进行验证。最近发展出来的modifier screen和clonal screen，前者是研究信号通路的很有力的手段，后者则用于一个基因的多种功能。现代遗传学已经基本上可以做到在特定的一小群细胞中以特定的时间表达或抑制表达某个基因。

生化手段与遗传学手段恰恰相反。它是首先建立一个功能性的检测体系，然后用传统的层析方法纯化蛋白。生化方法较遗传学方法优势在于能够揭示许多重要蛋白的新功能，而在gene screen中重要蛋白的突变体往往在胚胎期就死亡了，因而看不到成体的表型。王晓东关于cytochrome C在细胞凋亡中的作用就是一个很好的例子。gene screen是发现不了cytochrome C的，因为cytochrome C是电子传递链上如此重要的一个分子。他首先建立了一个in vitro的细胞凋亡的体系，然后试着加一些小分子物质如核酸等，看能否加快细胞凋亡的进程，结果发现了ATP和dATP，而且dATP的效果比ATP强一千倍(5)。依靠生化纯化蛋白的手段，他分别纯化出了cytochrome C,Apaf-1和caspase-9。

在现代生物学研究中，遗传、生化和分子互相渗透，在基因功能性研究和细胞信号通路的阐明中发挥了巨大的作用。

显微镜在细胞学说的建立中曾发挥过关键的作用。然而因为分辨率太低的原因，在很长一段时间内被生物学家们冷落。而今显微成像技术有复苏的趋势。促使显微成像技术再次倍受生物学家们关注有两个原因：一个是激光共聚焦显微镜的发明；另外一个是荧光标记技术的成熟。激光共聚焦显微镜最早由Minsky发明，有效的克服了普通光学显微镜因成像平面受到邻近平面发出的光的干扰而造成图像模糊不清的现象。随着计算机技术的进步，光学成像和图像处理技术进一步提高，激光共聚焦显微镜真正走上了生物学研究的舞台。荧光标记技术在生物学上的应用同样经过漫长的道路。尽管荧光标记的抗体在1941年就被应用在生物学研究上，但当时普遍认为抗体只能应用在对感染等免疫学的研究。直到后来人们才意识到，一些针对其他蛋白如actin或tubulin的抗体可以用相似的办法来制备。当这个观点为人们所普遍接受后，免疫荧光染色马上被应用到生物学其他领域。科学家们由此可以观察到细胞骨架的精细结构、胞内蛋白的定位。荧光技术同时在动态观察胞内Ca2+变化等方面得到应用。而当GFP发现后，科学家们更可通过基因工程技术将GFP标记的特异性蛋白导入细胞内来实时地监测生理状态下生物大分子的动态变化。Svoboda使用双光子荧光显微技术活体研究神经系统的可塑性应该真正是这方面的扛鼎之作。双光子成像的最大好处是激发波长在偏红外区域，可以穿透很厚的标本，同时对标本损伤很小，适于活体观察，光漂白作用也小。他们首次用这项技术观察到新形成的树突棘数目与小鼠barrel cortex发育过程中的可塑性之间的直接关系 ( 6 )。 成像方面胞内单分子监测越来越受到重视，FRET(能量共振转移)、TIRF（全内反射）等技术的不断成熟，使在活体状态下观察单个分子的运动成为可能。

总之，技术的进步可以说是推动实验生物学发展的主要动力。但是我觉得，进行有创造性的生物学研究的一个特点是，始终抓准最基础和最重要的问题，以正确的技术和合适的标本进行回答。Hodgkin, Huxley巧妙地运用电压钳技术，用特定的离子（K+,Na+,Cl-）进出轴突膜上的离子通道来解释动作电位的产生，最终诺贝尔奖授予他们而非发明膜片钳的人；Rod MacKinnon发现只有结构生物学能够彻底地解决钾通道的问题时，马上由一位电生理学家变为结构生物学家；王晓东也是一个突出的例子，他成功的关键在于，正确的运用技术（生化而非遗传）解决了关键的问题（细胞凋亡的上游信号通路）。成为科学家而非科学匠在于是不是能够驾驭技术而不致成为技术的奴隶。有时关键的问题是什么，大家都比较清楚，优秀的科学家还应能判断出何时能解决这些问题。生物学，或者说实验科学，本身就是一门解决问题的艺术。

3.我所感兴趣的神经发育科学

神经发育科学的主旨在于研究神经细胞如何分化成具有轴突和树突的神经元，细胞迁移和轴突长出是如何被诱导，特异的神经元是如何识别而形成功能性的突触，连接是如何在发育进程中被修剪和精细化的。

神经发育生物学中我最感兴趣的是神经元在发育过程中的极性(7)。极性包括两个方面：一个是神经细胞在形态发生中极性的形成---神经细胞在发育初期会伸出很多的神经突，其中某个神经突在发育后期会特化为轴突，其余神经突则特化为树突。轴突和树突在神经元信号传递中的功能是截然不同的，因此极性的建立、加强和维持就显得特别重要。我们可以问如下的问题：神经细胞最初的极性是如何建立的？有什么分子参与这一过程?极性是如何影响轴突和树突的长成的？轴突特异性蛋白和树突特异性蛋白如何在胞内定位？树突的分支比轴突复杂的多，这是为什么？不同神经元树突的形态很不相同，调控树突分支的分子机制是什么？神经元的极性在成体中又是如何保持的？这些都是很重要且有趣的问题。另一方面是极性在神经细胞迁移和轴突导向中的作用，轴突导向的过程为两类分子---短程分子和长程分子所介导。这两类分子在轴突生长锥附近形成梯度分布，排斥或者吸引正在生长的生长锥。例如ephrin就是结合在细胞膜上的，而且在神经系统的某些区域形成梯度分布，可以排斥正在生长的轴突。其他的分子比如netrin或者semaphorin，以扩散的形式分泌，可作为长程的吸引或排斥分子。这些胞外的信号分子造成胞内某些分子活性的极性分布，如CDC42和PI3K等，这些分子的活性进一步影响细胞骨架的重新分布，如actin和tubulin单体在生长锥的一边多聚化，在另一边解聚，从而引起轴突生长锥的转向。相当有意思的一个问题是，胞外信号分子如此微弱的浓度梯度是如何在胞内进行信号放大以指引生长锥正确的转向？

对于神经细胞轴突和树突的极性形成，一个有趣的比较是，轴突对应于上皮细胞的apical side，树突对应于上皮细胞的basolateral side(9)。比如最近发现在上皮细胞的极性确立中期重要作用的mPar3/mPar6/aPKC在神经细胞的极性形成中也有作用（10）。时松海等发现mPar3/mPar6/aPKC以及被活化的PI3K集中在发育中的神经细胞轴突的顶端，而异位表达mPar3/mPar6/aPKC或者抑制PI3K的活性都能有效的抑制轴突的长出，轴突特异性蛋白tuj1不再表达。轴突形成的下游效应分子是微管和微丝。Bradke等作了一个有趣的实验(11)：他们将微丝特异性药物cytochasin D局部地加在一条即将特化成树突的神经突上，发现它被诱导形成轴突。因此，有可能cytochasin D使微丝去稳定，有利于轴突的形成。但是在生理条件下，上游的信号分子如何调控微丝和微管的动态变化以建立神经元极性仍然是一个待解决的有趣的问题。微管与神经元极性的关系始于对一个微管结合蛋白CRMP-2的认识。人们发现在它特异的集中在轴突的顶端，当升高CRMP-2的表达时，有更多的轴突长出。最近的一片待发表的文章指出CRMP-2的上游调节分子为GSK-3(12)，而在以前的工作中证明了GSK-3在神经元迁移中的作用(13)。由此可见，在这两类极性的建立和发生中有些分子是保守的，如果认识到微管和微丝在轴突形成和轴突导向中的同样重要的作用，就更能深刻的理解这一点。最近证明某些胞外分子也能影响轴突的形成，如果让神经元在铺有polylysine和laminin（或者NgCAM）条形间隔的培养基上生长，那些接触laminin或者NgCAM的神经突较接触polylysine的神经突更易特化为轴突(14)。

经过二十余年的探索，已经证明相同的信号通路在轴突导向和不同的细胞迁移中（如肿瘤形成(tumoriogenesis)和血管形成(angiogenesis)中的细胞迁移、肿瘤细胞迁移(tumor metastasis)）被使用(15)。有关细胞迁移的领域，有很多杰出的科学家在进行孜孜不倦的探索，因为这实在是一个非常有趣的问题。只要稍微发挥一下想象力，就不难通过比较的方法找到对问题的突破口。比如chemokine一向是介导白细胞迁移的一类趋化分子，通过G蛋白耦联受体(GPCR)向胞内传递信号。最近发现轴突导向同样可以由GPCR所介导，并为SDF-1（属于chemokine的一种分子）所排斥(16)。又比如Slit最先是发现在轴突导向和神经元迁移中起排斥作用的， Wang Biao等的研究结果表明Slit2在肿瘤细胞中表达，而Slit的受体在血管上皮细胞中表达，肿瘤细胞释放Slit2吸引血管上皮细胞，促进血管形成，因此Slit-Robo信号通路在肿瘤血管形成中同样起作用(17)。既然胞外信号分子会影响轴突导向和细胞迁移，很容易想到的事情是：内因会不会影响神经元对胞外信号分子浓度梯度的反应？Poo Mu-ming的一系列开创性的工作证实了第二信使在轴突导向中的作用。他们发现胞内Ca2+的浓度直接影响轴突生长锥对于胞外信号分子的反应，特异性阻断Ca2+进入胞浆内以降低胞内Ca2+浓度，可以使原先netrin-1对于轴突的吸引作用变为排斥(18)。cGMP和cAMP也有类似的作用，提高胞内cyclic neucleotides的浓度可以使轴突对胞外信号分子的排斥效应变为吸引效应(19)。进一步的研究发现cAMP、cGMP和Ca2+是有crosstalk的，cyclic neucleotides能够调节L型Ca2+通道的通透性，升高和降低胞内Ca2+的浓度，进而调节轴突对外界信号的吸引或者排斥作用(20)。这些工作使我们对于第二信使在轴突导向中的作用有了比较完整的理解，并使对其他现象的深刻理解成为可能。如最近发现Sema 3A有对树突有吸引作用，这与它对轴突的排斥作用恰恰相反。对这个现象的解释是，guanylate cyclase (SGC)在轴突和树突中的不对称分布造成了cGMP浓度在轴突和树突中的不同，因而造成了轴突对同一种胞外信号分子的不同反应(21)。

发育生物学可以说是实验生物学的一个核心问题，而神经发育更是核心问题中最为神奇的地方和激动人心的发现的源泉。我对神经发育中的轴突导向和神经元极性确定方面的课题感兴趣的原因有两个：第一，细胞极性的问题本身是一个从对称走向不对称，从无序走向有序的问题，探索这一问题本身有着科学的美感，是很有趣的问题；第二，轴突导向反映细胞也是有智慧的，对不同的外界环境做出不同的反应，而正如外因和内因决定一个人的成长一样，外部环境和内在因素共同决定着轴突导向，因此在探索过程中将神经元拟人化去理解我觉得特别重要，也很有意思。神经发育科学中有很多有趣的和重大的问题尚待解决， 因此只要保持一颗好奇心，是不难找到用武之地的。